血管抑素下调人舌鳞癌细胞血管内皮

摘要:目的　探讨血管抑素(angiostatin,AS)对人舌鳞癌细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法　将Tca8113人舌鳞癌细胞移植到18只裸鼠皮下,用随机数字表法将裸鼠分成3组(每组6只)。PBS组:注射PBS;AS(250 ng)组:注射250 ng纯化AS;AS(30μg)组:注射30μg纯化AS,腹腔注射, 2次/d,同时测量肿瘤的大小, 2次/周。21 d后处死小鼠,将取出的每个肿瘤2等分,一半用免疫组织化学检测VEGF及其两个受体(VEGFR1、VEGFR2)和CD34,用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡;另一半用半定量RT-PCR检测VEGF、VEGFR1和VEG-FR2的mRNA表达。结果　AS(250 ng)组和AS(30μg)组中,细胞凋亡指数(AI)明显增加(P<0•05);而肿瘤体积、微血管密度(MVD,用CD34抗体标记并用来评价肿瘤血管生成)及VEGF、VEGFR1和VEGFR2在蛋白质和mRNA的水平表达,都有明显降低(P<0•05),且AS(30μg)组更为显着。结论　AS下调人舌鳞癌细胞VEGF的表达且呈剂量依赖性。

关键词:血管抑素;血管内皮生长因子;舌鳞癌

中图法分类号:R73-36;R730. 23;R739. 86文献标识码:A

Angiostatin down-regulates vascular endothelial growth factor expression in humantongue squamous cell carcinoma cellsLIU Zhi-gang,CHEN Fang-yu,JIANG Li-hui,WANG Tao(Department ofOral and Maxillofacial Surgery,DentalHospital ofChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400015,China)

Abstract:Objective　To evaluate the effects of angiostatin on vascular endothelial growth factor expres-sion in human tongue squamous cell carcinoma cells.Methods　Subcutaneous xenografts of human tonguesquamous cell carcinoma(Tca8113)cell line in BALB/c nude mice were employed and eighteen mice wererandomly divided into three groups(6 mice each):the PBS group injected with PBS,the AS group injectedwith 250 ng purified angiostatin,and theAS group injectedwith 30μg purified angiostatin. Reagentswere in-jected intraperitoneally twice daily and tumor volumewas calculated twiceweekly for21 d,then animalsweresacrificed and each tumorspecimenwasdivided into two parts aftersurgical resection. The firstpartwas submit-ted to both immunocytochemistry forVEGF,VEGFR1,VEGFR2 and CD34,andTUNEL apoptosis assay. Thesecond partwasprepared forsemi-quantitativeRT-PCR analysisofVEGF,VEGFR1 andVEGFR2mRNA abun-dance.Results　Therewas an increase ofapoptotic index(AI) (P<0•05)in theAS(250 ng)group and intheAS(30μg)group and therewas a decrease ofprotein andmRNA expression levelsofVEGF,VEGFR1 andVEGFR2,tumor volume andMVD(tumorangiogenesiswas estimated by usingCD34 antibody to determinemi-crovessel density) (P<0•05). These changesweremore obvious in the theAS(30μg)group than in theAS(250 ng)group(P<0•05).Conclusion　Angiostatin down-regulates vascular endothelial growth factor ex-pression in human tongue squamous cell carcinoma cells in a dose-dependentmanner.

Key words:angiostatin;vascular endothelial growth factor;tongue squamous cell carcinoma

血管抑素(angiostatin, AS)是纤溶酶原的内源性裂解片段[1, 2],是目前已知的最强的血管生成抑制因子(angiogenesis inhibitors)之一。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是对血管内皮细胞具有高度特异性的丝分裂原,是目前已知最强的血管生成因子(angiogenesis activators)之一,其最主要的成员为VEGF-A (VEGF-A包括VEGF121、VEGF165等)。VEGF-A的生物活性主要是通过同两个酪氨酸激酶受体的相互作用得以实现的,这两个受体是VEGER1(Flt-1)和VEGER2(Flk-1/KDR)[3]。人舌癌是最常见的口腔癌,其中又以鳞状细胞癌多见。Hajitou等[4]认为AS下调VEGF的表达具有肿瘤类型依赖性,且目前国内少见对舌鳞癌进行相关研究的报道。因此,本研究对AS与VEGF在舌鳞癌细胞中的关系进行探讨。

1、材料与方法

1. 1　材料

人舌鳞癌细胞株Tca8113由四川大学华西校区细胞生物学教研室提供。6~8周龄BALB/c裸小鼠均为雄性,共18只,体质量(18±2)g,购自北京医科大学实验动物中心。纯化人血管抑素购于Haemtech公司, RNAlater样品储存液购自BD公司,兔抗人多克隆抗体VEGF、Flt-1、KDR及CD34购自武汉博士德生物工程有限公司, S-P 9001免疫组化染色试剂盒和ZLI-9032浓缩型DAB试剂盒购自中杉金桥公司,凋亡试剂盒POD购自Roch公司,总RNA提取试剂(RNAiso Regent)、RNA PCRKit(AMV)Ver. 3. 0购自TaKaRa公司。

1. 2　方法

1. 2. 1　人舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤模型的建立在37℃、5% CO2的培养箱中,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液对Tca8113细胞进行常规培养传代。收集正处于指数增生期的第6代Tca8113细胞系,并用0. 01 mol/L PBS液稀释,调整细胞数为2×107ml-1。在每个裸鼠背部近中线处的皮下注射2×106个Tca8113细胞。

1. 2. 2　实验动物分组用随机数字表法将18只裸鼠分成3组,每组6只。PBS组注射100μlPBS,AS(250 ng)组注射250ng纯化AS(溶解于100μl的PBS液中),AS(30μg)组注射30μg[5]纯化AS(溶解于100μl的PBS液中),腹腔注射, 2次/d。注射从肿瘤细胞移植当天开始,持续21 d。

1. 2. 3　取肿瘤标本记录每只裸鼠肿瘤的长径和短径, 2次/周,肿瘤体积计算公式[6]:肿瘤体积=πab2/6, a为长径, b为短径。

经过21 d的注射后即断颈处死裸鼠,取出肿瘤,并将每个肿瘤切成2等分,一半保存在4%多聚甲醛中送本校组胚实验室制作成石蜡切片,另一半剪成0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5 cm的小块后按RNAlater样品储存液说明书保存。

1. 2. 4　免疫组织化学观察

1. 2. 4. 1　操作按S-P 9001免疫组化染色试剂盒中说明书分别对Tca8113肿瘤石蜡切片中的VEGF、VEGFR1、VEGFR2和CD34进行染色。VEGF、VEGFR1、VEGFR2和CD34一抗的效价均为1∶100;显色剂用ZLI-9032浓缩型DAB试剂盒,阳性表达的标准是细胞质被染成棕黄色。

1. 2. 4. 2　结果观察　①VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达的观察:用成都金盘电子科大多媒体技术有限公司GD-8型病理影像多媒体图文操作系统进行分析,主要参数是平均积分光密度(AIOD),即为阳性积分光密度/管壁面积,单位为IOD /μm2。②微血管密度计数(microvessel density,MVD):用CD34抗体对微血管进行标记。先在光学显微镜选取3个微血下管数量最多的区域,即“热点”,再在200倍视野下计数3个“热点”中微血管数量的总和然后除以3,即为MVD的值[7]。

1. 2. 5　TUNEL法检测按凋亡试剂盒说明书进行操作。阳性标准是细胞核被染成棕黄色。凋亡指数(AI)即是在光学显微镜200倍下随机挑选10个视野,计数100个细胞核中阳性细胞所占的百分比。

1. 2. 6　半定量RT-PCR检测

1. 2. 6. 1　提取总RNA剪取50~100 mg的Tca8113肿瘤组织,按RNAlater样品储存液和RNAisoRegent说明书进行,并用20μlRNase-free水溶解RNA,沉淀后备用。

1. 2. 6. 2　反转录反应检测RNA的浓度、纯度及完整性后将符合条件的RNA样品予以保留,并将其用RNase-free水稀释成500 ng/μl的工作液,然后按RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3. 0说明书配制反转录反应液,并在Mastercycler96常规PCR仪进行反转录反应,反应条件为42℃30 min、99℃5 min和5℃5 min。

1. 2. 6. 3　聚合酶链反应[8]引物设计见表1,稀释成20μmol/L的工作液。按RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3. 0说明书配制PCR反应液,并加入到反转录反应液反应结束后的体系中,然后在Mastercycler96常规PCR仪按如下条件进行PCR反应: 94℃温育2 min后进入循环过程,即94℃变性1 min, 60℃退火2 min, 72℃延伸3 min,共30个循环。循环结束后于72℃温育10 min,最后4℃保持。

1. 2. 6. 4　结果分析电泳结束后用Bio-Rad的GelDocXR凝胶成像系统成像,用QuantityOne软件进行分析,分析方法用条带轨迹定量法( trace tracking)。半定量值即是用目的DNA的曲线下面积光密度值总和与内参β-actin的曲线下面积光密度值总和之比,以此来反映目的mRNA的相对转录量。

1. 3　统计学分析

采用SPSS 12. 0统计软件进行双侧t检验。

2、结果

2. 1　免疫组化染色结果

2. 1. 1　VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫组化染色VEGF、VEGFR1、VEGFR2主要表达在肿瘤细胞质中,故PBS组、AS(250 ng)组和AS(30μg)组中VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫组化染色结果是肿瘤细胞质都被染成棕黄色。染色强度PBS组最强,AS(250 ng)组次之,AS(30μg)组最弱。见表2、图1。

2. 1. 2　CD34免疫组化染色CD34主要表达在血管内皮细胞质中, CD34免疫组化染色的阳性结果是血管内皮细胞质被染成棕黄色,故可以显示肿瘤的微血管并进行微血管计数。微血管计数的结果是: PBS组最多, AS(250 ng)组次之, AS(30μg)组最少。见表2、图2。

2. 2　TUNEL法检测凋亡的结果

肿瘤细胞凋亡后细胞核形成凋亡小体,经TUNEL法染色后呈棕黄色。凋亡指数PBS组(1. 0±0. 4)最小,AS(250 ng)组(4. 5±0. 7)次之, AS(30μg)组(72. 0±0. 9)最大。见表2、图3。

2. 3　RT-PCR产物

PBS、AS(250 ng)组和AS(30μg)组中VEGF、VEGFR1和VEGFR2的RT-PCR电泳图显示了所有预期的扩增产物大小(VEGF165、VEGF121: 535、403 bp; VEGFR1: 498 bp; VEGFR2:709 bp;β-actin: 534 bp)和扩增产物相对表达量(总吸光度值)。相对表达量PBS组最多,AS(250 ng)组次之,AS(30μg)组最少。见表2及图4。

AS(250 ng)和AS(30μg)组中,AI明显增加(P<0•05),而肿瘤体积[分别为(813. 0±83. 8)、(25. 5±6. 5)mm3, PBS组为(1 511. 0±110. 1)mm3]和微血管密度计数(MVD)[分别为(50. 2±10. 0)、(25. 5±6. 5)个, PBS组为(150. 5±12. 1)个]以及VEGF、VEGFR1、VEGFR2在蛋白质及mRNA水平表达都有明显降低(P<0•05),且AS(30μg)组更为显着。见表2。

3、讨论

AS能够抑制肿瘤的生长和血管生成,这在不同种类的肿瘤实验中都得到了证明[4, 5]。本实验中, AS(250 ng)组和AS(30μg)组相对于PBS组,在肿瘤体积和MVD方面都有明显的减小(或减少)(P<0•05),而AS(30μg)组比AS(250 ng)组又更为明显(P<0•05),说明AS也能抑制Tca8113舌鳞癌的生长和血管生成。

“血管生成切换”[1]是解释AS抑制Tca8113舌鳞癌的生长和血管生成的理论基础,认为血管生成因子(angiogenic factors)和血管生成抑制因子(angiostaticfactors)共同调控血管生成。对于肿瘤而言,是血管生成还是血管抑制,取决于血管生成信号的总和与血管抑制信号的总和之间的抗衡。而VEGF是最为重要的血管生成因子,AS是最为重要的血管生成抑制因子,因此,二者在肿瘤中的对抗,对于肿瘤的血管生成无疑起着决定性的作用。本实验使用了AS,所以最终抑制了舌鳞癌的血管生成,而血管生成的抑制必然导致其生长的抑制。

关于AS和VEGF之间的关系,Hajitou等[4]认为:AS下调VEGF的表达具有肿瘤类型依赖性,即某些种类的肿瘤中AS下调VEGF的表达,而在另外一些种类的肿瘤中AS并不下调VEGF的表达。目前已知AS下调C6、9L、PDVA和EF43. fgf-4肿瘤中VEGF的表达,不能下调EC-4、U87肿瘤中VEGF的表达。

AS是否能够下调Tca8113舌鳞癌中VEGF的表达?我们的实验数据表明: AS(250 ng)组和AS(30μg)组相对于PBS组,在VEGF及其两个受体VEG-FR1、VEGFR2的表达方面(在蛋白质水平和mRNA水平上)都有明显的减少(P<0•05),而AS(30μg)组比AS(250 ng)组又更为明显(P<0•05)。据此可推测,AS能够下调Tca8113舌鳞癌中VEGF的表达,而且呈剂量依赖性[9]。

AS下调肿瘤中VEGF的表达的机制目前尚少见报道。VEGF主要是由肿瘤细胞合成和分泌的,可以肯定,肿瘤细胞在数量上的减少应该是AS下调肿瘤中VEGF的表达的原因之一。那么,AS是如何减少肿瘤细胞的或者说是如何杀灭肿瘤细胞的?我们认为有两个方面的机制:其一,肿瘤生长依赖于血管生成,而AS能够通过各种机制[1]抑制肿瘤的血管生成,血管数量的减少必然导致肿瘤细胞氧气和营养物质供应不足以及代谢产物蓄积,从而导致部分肿瘤细胞最终死亡。其二,最近, Chi等[10]研究发现AS在细胞外低pH值条件下能够通过肿瘤细胞表面的ATP合酶而对肿瘤细胞起直接的细胞毒作用,并发现AS对肿瘤细胞的直接细胞毒作用导致肿瘤细胞的大量凋亡。而本实验数据表明:AS(250 ng)组和AS(30μg)组相对于PBS

组,在肿瘤细胞的AI都有明显的增多(P<0•05),而AS(30μg)组比AS(250 ng)组又更为明显(P<0•05)。这两方面的机制相互配合,结果导致大量的肿瘤细胞被杀灭。大量的肿瘤细胞被杀灭则必然导致VEGF表达的下调。

本研究表明AS能够下调Tca8113舌鳞癌中VEGF的表达,而且呈剂量依赖性。从我们的实验可以看出,在AS的作用下,VEGF的变化与肿瘤TUMORVOLUME和MVD的变化是一致的,而与AI的变化是相反的,而且呈剂量依赖性。所以,VEGF表达的变化程度可以作为评价AS治疗Tca8113舌鳞癌疗效的一个指标。VEGFR1、VEGFR2也可以作为评价AS治疗Tca8113舌鳞癌疗效的一个指标。

参考文献:

[1] WahlM L, Kenan D J, Gonzalez-GronowM,etal. Angiostatin’smo-lecularmechanism: aspectsofspecificity and regulation elucidated[J].JCellBiochem, 2005, 96 (2): 242-261.

[2] HanfordH A, WongC A, KassanH,etal. Angiostatin(4. 5)-media-ted apoptosis of vascular endothelial cells[ J]. Cancer Res, 2003, 63(14): 4275-4280.

[3] Takahashi H, Shibuya M. The vascular endothelial growth factor(VEGF)/VEGF receptor system and its role underphysiologicaland path-ological conditions[J]. Clin Sci (Lond), 2005, 109(3): 227-241.

[4] Hajitou A, Grignet C, Devy L,et al. The antitumoral effect of en-dostatin and angiostatin is associatedwith a down-regulation ofvascularendothelial growth factor expression in tumor cells[ J]. FASEB J,2002, 16(13): 1802-1804.

[5] BeerepootLV, W itteveen E O, Groenewegen G,et al. Recombinanthuman angiostatin by twice-daily subcutaneous injection in advancedcancer: a pharmacokinetic and long-term safety study[J]. Clin CancerRes, 2003, 9(11): 4025-4033.

[6] An P, LeiH, Zhang J,etal. Suppression of tumorgrowth andmetas-tasis by a VEGFR-1 antagonizing peptide identified from a phage dis-play library[J]. Int JCancer, 2004, 111(2): 165-173.

[7] KyzasPA, StefanouD, AgnantisN J. Immunohistochemical expressionof vascular endothelial growth factor correlates with positive surgicalmargins and recurrence in T1 and T2 squamous cell carcinoma (SCC)of the lower lip[J].OralOnco,l 2004, 40(9): 941-947.

[8] Masood R, Cai J, Zheng T,et al. Vascular endothelial growth factor(VEGF) is an autocrine growth factor forVEGF receptor-positive hu-man tumors[J]. Blood, 2001, 98(6): 1904-1913.

[9]季平、李庆妹、张福军等. RNAi沉默c-erbB-2、c-raf-1表达对人舌鳞癌Tca8113细胞的干预作用[ J].重庆医科大学学报,2004, 29(5): 567-571.

[10] Chi S L, Pizzo SV. Angiostatin is directly cytotoxic to tumor cells atlow extracellularpH: amechanism dependenton cell surface-associat-ed ATP synthase[J]. CancerRes, 2006, 66(2): 875-882.