牙周再生术治疗中微环境的构建和维

综述与讲座：

本研究项目由国家自然科学基金资助(30600657)通讯作者:谭震, 四川大学华西口腔医院,四川　成都　610041

从1976年Melcher提出牙周再生潜能和牙周创口根面优势细胞决定愈合形式[ 1 ] ,到近年来有学者提出相当数量的相关细胞和活化特定细胞的生化因素决定牙周缺损的修复,以及根据此类理论建立的引导组织再生技术( Guided TissueRegeneration, GTR) 、局部运用釉基质蛋白和其他多肽生长因子等牙周再生治疗手段,都是着眼于刺激局部内源性或外源性细胞(包括相关干细胞) ,发挥其修复功能。而牙周再生手术的愈合过程是一个非常复杂的过程,涉及血凝块和血肿形成(防止血细胞丢失) 、免疫细胞浸润和炎症反应(防止感染并除去组织碎片) 、周围细胞的动员(细胞增殖分化形成修复芽基)三个既有区别又相互交错的阶段。其中,细胞增殖分化形成骨、牙骨质和牙周膜三种结构是决定修复结果的核心环节,该过程受诸多四川大学华西口腔医院口腔种植科谭震。

具有时间和空间效应的因子和细胞介导,这就是细胞生存的微环境。细胞的生物学行为会受到细胞所处的微环境影响已得到许多研究的证明,如Spees等用热休克方法刺激了上皮细胞,发现与上皮细胞共培养的间充质干细胞(mesenchymal stemcells, MSCs)能迅速表达上皮细胞的表型标志,说明局部相关细胞损害刺激可能在MSCs分化中起重要作用[ 2 ]。Kramer等用免疫组化和原位杂交等方法检测共培养后的MSCs和PDL细胞,发现MSCs骨钙素( osteocalcin, OC) 和骨桥蛋白( osteopontin,OPN)的表达量明显增加,而骨涎蛋白( bone Sialop rotein, BSP)的表达量明显降低,这正是牙周膜细胞的特性,也就是说共培养的MSCs获得了牙周膜细胞的特性[ 3 ]。故而有学者提出体内移植的MSCs 能在局部微环境中通过基因组重编程

(Reprogramming) ,分化成与其周围细胞生物学特性相似的细胞。微环境对干细胞的这种诱导分化现象,被称为“局部专一诱导性分化”( site - specific differentiation) [ 4 ]。

近年来,颅面部组织工程为牙周组织再生带来了前所未有的希望,并提出牙周再生的四大关键因素,即种子细胞、支架材料、血供和生物信号分子,其核心问题也是种子细胞的选择和分化调控、功能表现[ 5 ]。组织工程的主要目的也就是为参加牙周再生的主要细胞创造一个合适的生长微环境。牙周微环境

涉及到的因素很多,为了系统了解牙周再生过程中在创口微环境构建和维护过程中可能涉及到的相关干扰因素,促进牙周再生研究的发展,本文从牙周再生治疗中所涉及的相关微环境因素及目前的应对策略作系统的综述,着重介绍目前牙周再生领域的研究成果以及组织工程学在该领域中的应用。

1、微生态因素

口腔是人体四大菌库之一,微生物与宿主、微生物相互间存在着广泛而复杂的相互制约、相互依赖关系,共同维持着牙周及口腔微生态的平衡。这种不同微生物之间的动态平衡、宿主与微生物之间的动态平衡是决定牙周健康的重要因素。近年来的研究已充分表明,在龈沟微生物中,致病菌与另一些能抑制

这些致病菌生长的有益菌群如血链球菌等共存。有益菌的减少或消失、动态平衡的破坏是牙周病变发生的重要机理[ 6, 7 ]。有学者据此提出牙周病的“替代治疗”,即是指牙周病治疗的成功不仅要去除致病菌,还要获得有益菌的再定植,如将血链球菌引入患者牙周,但这还需要大量的研究来解决诸如细菌定植等关键问题[ 8 ]。局部感染会产生一些毒素和酶,增加局部伤口的张力进而妨碍愈合。由于口腔环境的复杂性及复杂的功能活动,如何阻止口腔中的微生物与牙周创口相交通、控制感染、保护创口的愈合不受外来因素干扰更是亟待解决的问题。为了阻断牙结石及炎性组织对牙周进一步的损害,防止细菌和毒素对创口的不利影响,在术前进行洁刮治术和根面平整( scaling and root p laning,SRP) 、去除菌斑积聚的龈上牙石和龈下牙石,可以改善牙周微环境,将有助于牙周组织的再生。并且根据需要结合全身或局部使用抗生素、漱口液含漱可以帮助控制口腔微生物的总量。在此基础上进行牙周再生手术,术中用枸橼酸或四环素等对根面进行一定的预处理,严密缝合创口,术后创口上塞治剂、进流质饮食和定期进行牙周护理,防止创口裂开,并结合口服抗生素、洗必泰含漱减少感染的发生率[ 9 ]。抗生素的治疗不能仅仅依靠经验,而应该针对实验室检查如相差显微镜、酶检测法、细菌培养法和PCR检测的结果,根据不同的微生物的敏感性选择相应的治疗方案[ 10 ]。

2、细胞生长和牙周再生的空间问题

作为机体组织的细胞,其社会性既表现细胞生长的群体依赖性,也表现细胞的增殖和凋亡。如缺损区周围细胞分裂增生迁移,逐渐替代创区的血肿,当这些细胞逐渐填满创区而相互接触时,细胞就停止生长不致堆积,这种现象称为接触抑制,因此,牙周再生需要给予一定的空间,以确保牙周组织前体细胞增殖分化并发挥其功能[ 11 ]。

目前,牙周再生的临床及动物实验研究主要通过两方面解决牙周组织再生的空间问题,一种是采用屏障膜,另一种是采用支架材料(如植骨材料等) ,或者两者结合运用。如果仅采用屏障膜,则宜选择增强膜(多为不可吸收膜) ,以通过膜本身的塑形来控制细胞再生的空间,这同时也是引导骨组织再生(GuidedBone Regeneration, GBR)的一个重要原则。

3、血供及营养问题

局部血液循环一方面保证组织再生所需的氧和营养,另一方面对坏死物质的吸收及控制局部感染也起重要作用。因此,局部血流供应良好时,则再生修复好,相反,如局部血液循环不良时,则该处伤口愈合迟缓。创口血供包括两个方面:粘骨膜瓣的血供和创口内牙周再生区域的血供。粘骨膜瓣的血供对于防止创口坏死、裂开,保护创口非常重要。而创口内在术后24 h即形成血凝块, 随后白细胞以中性粒细胞为主开始在创口部位聚集,通过吞噬作用清除创区的细菌和坏死组织。3 d后转为以巨噬细胞为主,继续清理创口,并分泌多肽物质调节靶细胞在创区愈合中的活动[ 12 ]。

在随后的数天和数周内,血凝块吸收,肉芽组织形成。肉芽组织有大量的血管结构,这对随后骨基质的形成、矿化为编织骨,最后转变为成熟的板层骨都是极为重要的[ 13 ]。需要提及的是在使用GTR技术时粘骨膜良好的血供也可以防止膜的暴露,而放置不可吸收膜也可能影响牙龈瓣与创区新生组织的血管

交通[ 14 ]。

对于粘骨膜瓣的血供问题,主要应注意切口的设计,并进行无张力缝合。而创口内血供则通过在创区骨面上制备滋养孔,使具有血管形成潜能的干细胞进入创口,同时这些干细胞也会直接参与组织的再生。创区的一些生长因子也会影响到局部的血供,如在牙周病的愈合阶段,局部血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)表达明显升高,能促进血管生成,改善血供[ 15 ]。有学者推测碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factors, bFGF)促进牙周再生的重要原因之一就是bFGF能促进Go静止期内皮细胞的形态发生和增殖,对新生血管形成的毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生等

多个环节均有明显促进作用,能促进创区局部血管的形成,为移植细胞的存活和牙周愈合早期细胞活动创造必要的条件[ 16 ]。因此,局部应用可以促进血管生成的生化因子也是改善局部血供的手段之一。

4、创区其它生化因素

牙周组织的修复和重建,有赖于牙周特定细胞如牙周膜细胞向界面局部移行、吸附、定植、增殖、基质合成等功能表现[ 17 ]。现有的研究表明多种细胞因子、系统激素可以干扰或促进这一过程。相关的研究主要集中于发现有利于牙周前体细胞移行和增殖的生物学因素,并运用它们来改善创口的微环境,促进牙周再生。骨形态发生蛋白(BoneMorphogenetic Protein,BMP) 2、12 也能促进牙周组织的再生[ 18, 19 ]。Ripamondli在磨牙根分叉区病变的动物模型中,用复合有骨形成蛋白7的I型胶原作为仿生支

架,观察到有新生的牙槽骨、牙骨质和位于牙根表面的Sharpey’s纤维出现[ 20 ]。

此外,碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growthfactors, bFGF)能促进牙周膜细胞、成骨细胞及MSCs的增殖。Murakami等应用人重组bFGF治疗beagle犬Ⅱ类根分叉缺损, 6周后观察结果发现实验侧新生的牙周韧带、牙骨质及新骨明显多于对照侧[ 21 ]。同时有研究表明bFGF通过与MSCs表面的

bFGFR结合,促进MSCs的分裂增殖,是MSCs体外扩增最常用的手段之一[ 22 ]。近年来, 釉基质蛋白衍生物( enamel matrixp rotein derivative, EMD)在牙周再生的作用越来越被口腔学术界重视,临床观察到治疗后牙周袋深度明显减小、临床附着水平呈明显改善,其主要作用是应用其牙骨质发育中可以诱导牙囊细胞分化为成牙骨质细胞的机理,试图通过重新启动牙周组织发育的途径,解决目前牙周组织再生难以实现的现状[ 23, 24 ]。国内学者采用中药黄芪多糖复合于支架材料上,发现其对MSCs有促增殖、分化和基质分泌的作用,可以促进牙周组织的修复,这为组织工程化牙周组织开辟了新的途径[ 25 ] 。

近年来如何应用外源性因子促进牙周再生这一过程是众多学者的研究热点,如局部多次注射、建立因子缓释和智能控释系统、采用基因工程等手段已被广泛应用于动物试验。目前,采用基因治疗手段被认为最有应用前景,其构思主要基于用载体来进行目的基因的转移,转移对象主要是体细胞,按转移方式基因治疗分为体外基因治疗、原位基因治疗、体内基因治疗三种类型。一般来讲,目前在牙周组织再生等领域多采用第一种方法,即将从机体取下的细胞经与构建好的载体一起培育后得到基因工程细胞,此细胞具有表达目的基因的功能,将其放回体内,因目的基因的激活表达而起到治愈疾病的作用。基因治疗中,获得高效率转染、持久高水平的基因表达是治疗成功的关键。由于干细胞具有无限自我更新和多向分化潜能,一直是基因治疗首选的靶细胞[ 26 ]。基因治疗手段在牙周再生中的应用主要是为细胞在局部的功能活动提供特定的生物信号分子,通过这些信号分子使牙周局部组织中特定的细胞产生有助于组织愈合的生物学行为。当然,这些因子的作用对象除了内源性的牙周细胞成分外,还会对靶细胞本身产生作用。牙周创口的愈合过程涉及到大量的信号分子,有些信号分子能促进成骨细胞的活力,通过促进牙槽骨沉积间接加速牙周再生,而有些则能直接促进牙周膜细胞的功能活动。如何选择合适的信号分子并控制其作用的时空因素是本领域需要解决的一个难题。

5、植入材料

上述所涉及的因子缓释材料、牙周植入的骨替代材料、屏障膜材料、组织工程中细胞的支架及载体材料都会从某种程度上改变牙周的微环境,如果要达到较好的牙周再生效果,这些材料在植入后及其降解过程中都不会对牙周前体细胞产生不利影响。其中,牙周组织工程材料的研究思路目前主要是通过构建

细胞与生物材料复合物,细胞在支架材料中生长、增殖,分泌细胞外基质取代逐渐降解的生物材料,最终形成具有活力的组织,修复牙周缺损。现在大多数研究都采用把组织工程其他领域的支架材料(如骨组织工程支架、药物缓释材料等)直接或通过简单的修饰用于牙周组织工程[ 27 ]。现在实验研究中常采用的几种材料分别是胶原凝胶、藻酸盐凝胶、Bio - Oss、Bio - OssCollagen复合体、骨衍生材料及其它生物合成材料如β - TCP、珊瑚人工骨材料、生物活性玻璃、壳聚糖、注射型磷酸钙骨水泥等[ 28 ]。凝胶类载体材料强度欠佳、容易流失, Bio - Oss Collagen复合体在细胞复合过程中强度明显降低,含有异种异体蛋白的材料可能还会引起机体的免疫反应。而且,牙周再生有其特殊性,如对于牙周缺损较大的病例则需要支架材料具备一定的力学强度,以支持缺损区组织再生的空间;而对于垂直向的牙周缺损(骨内袋)如果采用细胞移植或组织工程方法治疗,那植入材料主要起一个载体的作用,其力学性能要求较低;牙周再生需要多种细胞形成多种组织,因此支架材料对干细胞的分化应无不良干扰;植入材料的性质,如是否可以吸收、是否具有骨传导功能(osteoconductive)以及材料的强度和密度都会直接影响创区组织的再生。不可吸收材料会通过占据组织再生的空间从而减少再生的效率[ 29～31 ]。

而且牙周组织在愈合过程中易受到口腔这一特殊环境的干扰,材料最好能具备一定的抗菌抑菌功能;再者,组织工程中一般要求生物材料的降解速度与牙周组织再生速度相当,降解产物能为牙周再生提供原料,但牙周三种组织的再生顺序、速度可能存在一定的差别。因此,构建多材料复合结构支架或梯度材料用于牙周组织再生可能是今后的研究方向[ 32 ]。

目前牙周再生的研究不仅着眼于寻找更为理想的种子细胞,更要考虑到构建并维护一个合适的微环境,以引导相关前体细胞在创伤愈合过程中正确发挥其功能,达到理想的牙周再生效果。在牙周再生中生化因子和植入材料的应用是目前本研究领域的两个热点,与相关学科如细胞生物学、分子生物学和生物材料学的交叉研究也越来越广泛,具有重要的研究价值和前景。

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