血管生成抑制剂TNP-470抑制腺样囊性癌转移的实验研究

【摘要】　目的：观察血管生成抑制剂TNP-470对人涎 腺腺样囊性癌肺转移的抑制作用。方法：将腺样囊性癌ACC-M细胞接种于裸鼠尾静脉(1×106/鼠)。将20只裸鼠随机分成对照组和治疗组，自第2天起分别给予溶剂(3%酒精)和TNP-470(40mg/kg)，隔天给药1次，共用4周。接种后6周末处死动物，检测对照组和治疗组的肺转移率及含转移灶的肺重量，观察转移情况。结果：对照组和治疗组肺转移率分别为90%和40%(P＜0.025)；含转移灶的肺重量分别为0.2138g±0.0667g和0.1685g±0.0445g(P＜0.05)。结论：血管生成抑制剂TNP-470能明显抑制腺样囊性癌的肺转移。

【关键词】　腺样囊性癌  血管生成抑制剂    TNP-470    肿瘤转移

腺样囊性癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，易发生远处转移，转移部位以肺部最多见。自七十年代Folkman提出“三维空间生长的实体瘤在2mm3以后是绝对血管生成依赖性的”以及“抑制肿瘤的血管生成可导致抑制肿瘤转移”的假说之后，抗肿瘤血管生成剂在抑制肿瘤转移中的作用日益引起重视。TNP-470是近年来发现的半合成的烟曲霉素衍生物，有较强的抗血管生成活性，据报道，对多种肿瘤的生长具有抑制作用［1 ，2］。我们对TNP-470抑制腺样囊性癌的转移进行了实验研究，旨在探讨一种抑制腺样囊 性癌转移的方法。

材料和方法

1.实验材料：①细胞株：选用经过筛选并克隆化的肺高转移性腺样囊性癌ACC-M 细胞株，由上海第二医科大学口腔医学院提供；PRMI-1640+15%小牛血清37℃密闭培养。② 动物：3周龄雌性BALB/C nu/nu裸小鼠，由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供，SFP 条件下饲养。③药物：TNP-470，烟曲霉素衍生物(日本OsaKa,Takeda化学公司Miyashita.O 和Ikeda.H博士惠赠)，其结构参见文献［3］。

2.实验方法：①细胞悬液：取体外培养的并处于指数增长期的ACC-M细胞，经 0.125%胰 酶消化，吹打成细胞悬液，经苔盼蓝染色确认活细胞达95%以上，经1000r/min离心5min，弃去上清，加入Hank’s液，吹打后再经离心，重复3次。用Hank’s液调整细胞数为5×106/ ml。②肺转移模型：将裸鼠放入固定器中，在严格无菌条件下经尾静脉注入细胞悬液0.2 ml(1×106个细胞)。③治疗：将20只裸鼠随机分成对照组和治疗组，两组裸鼠体重差异无显著性(15.44±0.86，15.58±0.66；t=0.28，P＞0.5)。用药剂量参照Kusaka等［4］的方法，治疗组给TNP-470(40mg/kg)，对照组给相应溶剂(3%酒精)，皮下注射给药。接种后第2天起，隔天给药一次，共4周。④疗效观察：给药期间观察裸鼠的一般状况，于接种后第6周末断颈处死裸鼠。称体重后解剖出肺脏，用电子天平称重，再将其用Bouin氏液(饱和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰醋酸5ml)固定。48小时后观察，肺组织呈黄色，肿瘤转移灶成白色隆起。于解剖显微镜下计数肿瘤转移灶的大小及数目，最后进行组织病理学检查。⑤两组间裸鼠体重及肺重用t检验，肺转移率用χ2检验。

结果

1.两组肺转移率及转移结节：对照组10只裸鼠中有9只发生了肺转移，治疗组10只中有4只发生了肺转移，经χ2检验，两者差异有显著性(P＜0.025)。对照组9只肺表面转移结节数为27±8个，用药组4只结节数仅为12±6个，可见用药组的转移结节数目 也明显低于对照组。

2.含转移灶肺重：对照组含转移灶肺重0.2138g±0.0667g，用药组0.1685g± 0.0445g；用药组肺重明显小于对照组，二者差异有显著性(P＜0.05)。

3.组织病理学检查：对照组裸鼠肺表面及实质内可见明显转移瘤灶，体积大，细胞排列成实性团块，细胞呈园形或多边形，排列紧密，胞浆染色较浅，嗜伊红。细胞核园形，核分裂多见；染色质排列疏松。瘤块中央细胞有变性坏死。肺小淋巴结及小支气管内亦可见转移瘤灶形成。用药组肺转移灶数量少，体积明显减小，多位于肺表面，瘤细胞体积小，细胞之间有 裂隙，核分裂少，肺内小淋巴结及小支气管内未见转移瘤灶形成。

4.一般状况观察：在整个用药期间，应用TNP-470的裸鼠活动良好，饮食正常，未见感染等不良反应，处死时体重为20.92g±4.94g；对照组裸鼠自第5周左右开始出现消瘦，体重下降，处死时体重为12.49g±3.59g，二者差异有显著性(P＜0.05)。

讨论

肿瘤组织生长到2mm3上时，需要有新生血管生成才能继续增殖，新血管生成是肿瘤转移的重要条件之一。在浸润性乳癌和小细胞肺癌中均发现，肿瘤组织块内部的微血管数与局部或远处转移明显相关［5］，也与手术放疗后复发、转移有直接关系。可见，血管生成抑制剂可望在抑制肿瘤转移方面发挥巨大效应，为癌侵袭、转移治疗的突破带来 了希望。

TNP-470是在烟曲霉素碱性水解产物烟曲素醇结构的基础上合成的衍生物，能显著抑制血管 内皮细胞的增殖，抑制鸡胚尿囊膜和大鼠角膜血管生成和抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFG F)诱导和血管生成；对多种肿瘤细胞的体外生长也有一定的抑制作用；在大鼠动脉段培养中 TNP-470可抑制内皮细胞形成毛细管状结构，而对非内皮细胞的生长几乎无影响［6］。因此可以认为，TNP-470是通过抑制血管内皮增埴而抑制肿瘤血管生成的。

TNP-470还能抑制小鼠软骨肉瘤的肺转移和人移植性结肠癌的肝转移［7］，Mori等 ［8］研究证明，给荷瘤动物TNP-470以后，在肿瘤的生长和转移受到抑制的同时，肿瘤 的血管密度也明显减少。

本研究表明，单独应用TNP-470对移植在裸鼠上的人腺样囊性癌的转移即有显著抑制作用， 对转移的抑制不仅表现为肺转移率降低，还表现为肺转移结节数目减少和含转移灶肺重降低 ，而且转移灶计数多者其含转移灶的肺重量也增加。

实验中用药组裸鼠未见明显的毒副作用，动物体重变化不明显；对照组由于腺样囊性癌肺转移在晚期出现恶病质，体重下降明显。长期应用低毒性的血管生成抑制剂，在抑制肿瘤复发及转移中具有重要意义，如能将其与手术、化疗、放疗等方法联合应用于腺样囊性癌的治疗 ，相信会具有良好的前景。

参考文献

1.Antoine N,Bours V,Heinen E,et al.Stimulation of human B- lymphocyte proliferation by AGM-1470:a potent inhibitor of angiogenesis.J Natl C ancer Inst,1995,87:136.

2.Yamaoka M,Yamamoto T,Masaki T,et al.Inhibition of tumor growth and metast asis of rodent trmors by the angiogenesis inhibitor fumagillol (NTP-470).Cancer Res,1993,53(18):4262.

3.Ingber D.Fujita T,Kishmoto S,et al.Synthetic analogues of fungillin that inhibit angiogenesis and suppress tumour growth.Nature,1990,348:555.

4.Kusaka M,Sudo K.Fujita K,et al.Potent anti-angiogenic action of AGM-1470; compatrison to the fumagillin parent.Biochem Biophys Res Commun,1991,174(3):1070 .

5.Basari S,Lee AK,Delellis RA,et al.Microvessel quantitation and prognosis in invasive breast carcinoma.Hum Pathol,1992,23(7):755.

6.Gasparini G,Weindner N,Bevilacqua P,et al.Tumor microvessel denisity,p53 expression tumor size and pertumoral lymphatic vessel invasion are relevant prog nostic markers in node-negative breast carcinoma.J Clin Oncol,1994,12(3):454.

7.Tanaka T,Konno H,Matsuda I,et al.Prevention of hepatic metastasis of huma n colon cancer by angiogenesis inhibitor TNP-470.Cancer Res,1995,55(4):836.

8.Mori S,Ueda T,Kuratsu S,et al.Suppression of pulmonary metastasis by angi ogenesis inhibitor NTP-470 in murine osteosarcoma.Int J Carcer,1995,61:148.